Изучение факторов рестрикции ВИЧ – белков, которые ограничивают размножение вируса, – важно для понимания эволюции врожденной невосприимчивости к ретровирусам. Например, ВИЧ не размножается в организме мышей и обезьян, что обеспечивается множеством факторов естественной невосприимчивости клеток к вирусу. У человека также включаются механизмы клеточной резистентности к ВИЧ, однако вирус с помощью своих вспомогательных белков выключает эти механизмы.
В рамках проекта планировалось найти новые факторы рестрикции, противодействующие размножению ВИЧ, а также вскрыть механизм их действия на вирус. Это позволит глубже понять патогенез СПИДа на ранних стадиях заражения и выработать новую стратегию усиления естественной резистентности к ВИЧ. «Опубликованная работа явилась частью большого проекта РНФ. Мы получили Т- и В-клетки человека, в которых каждая клетка несет в себе нокаут одного гена», – сказал руководитель гранта РНФ, кандидат медицинских наук Дмитрий Мазуров.
Нокаут гена представляет собой его «выключение» в организме. Нокаутные организмы помогают узнать о функции генов, которые можно установить по различиям между нокаутным и нормальным организмом. «Всего таких вариантов нокаутирования более 100 тысяч, что составляет так называемую библиотеку нокаутов. Используя данную библиотеку, мы смогли идентифицировать специфичность ранее полученного неизвестного антитела», – комментирует руководитель гранта РНФ.
Ученые использовали разработанную на основе CRISPR/Cas9 библиотеку нокаутов GeCKO. Методами иммунофлюоресценции, проточной цитометрии и клеточной сортировки были изолированы редкие клетки, с которыми антитело не связывается. Методами секвенирования ДНК были определены гены, нокаутированные в отсортированных клетках, и выявлен белок, с которым реагирует антитело.
«Имея в арсенале библиотеку клеточных нокаутов, можно характеризовать и идентифицировать моноклональные антитела с неизвестной специфичностью. Данная ситуация возникает в том случае, если антитело не работает в методах иммунопреципитации и иммуноблоттинга или связывается с углеводной частью белка», – заключил Дмитрий Мазуров.